cryptopolicy (cryptopolicy) wrote,
cryptopolicy
cryptopolicy

Categories:

Про специфичность иммуноферментных тестов на ВИЧ

Есть некоторые сомнения, что существует связь между тестами, изучаемым в лабораториях клонированным ретровирусом ВИЧ и СПИДом. 

Вот первый патент Галло на тесты "Serological detection of antibodies to HTLV-III in sera of patients with AIDS and pre-AIDS conditions" от Apr 23, 1984.

Цитата из него:
"HTLV-III was purified from supernatants of cell cultures supporting the continuous production of these cytopathic viruses. These HTLV variants (HTLV-III) lack immortalizing (transforming) properties for normal T-cells and mainly exhibit cytopathic effects on the T-cell helper. The cytopathic effect was overcome by finding a highly susceptible, permissive cell for cytopathic variants of HTLV, thus preserving the capacity for permanent growth after infection with the virus. These cell cultures allow for the continuous production of the HTLV-III virus. Cell line HT is infected with HTLV-III virus in order to obtain a reproducible source of the virus.".

Каким-то образом Галло смог создать бессмертную клеточную линию лимфоцитов, зараженную вирусом, в которой он непрерывно реплицируется. Что это еще за Т-хелперы такие, которые не подвержены цитопатическому эффекту вируса, но при этом обеспечивают его репликацию? 

Я так понимаю, что эта клеточная линия существует и сейчас, ее можно купить:
https://aidsreagent.org/reagentdetail.cfm?t=cell_lines&id=64

Есть мнение, что малигнизированные клетки в ней делятся так быстро, что вирус не успевает их прибить. Но можно показать, основываясь на графике из работы Галло, что в малигнизированной культуре при условном линейном росте числа клеток рост числа вирионов будет экспоненциальным. При таком соотношении в какой-то момент все клетки будут заражены. Получается крайне неустойчивая система, которая, между тем, находится в устойчивом состоянии уже 30 лет. Так не бывает.

Следует понимать, что само существование подобной клеточной линии опровергает связь между ВИЧ и СПИД.

Теперь про тесты.
Вот цитата о технологии получения вирусных антигенов из этого же патента:
"HTLV-III was concentrated by ultracentrifugation from virus producer culture supernatants (H9/HTLV-III.sub.B) and after careful removal of lipids and cell debris by centrifugation through a cushion of 20% (W/W) sucrose in TNE buffer (10 mM Tris-NaCl, pH 7.4, 0.1 M NaCl and 0.001 mM EDTA) was purified by equilibrium density banding through a linear gradient of 20-60% sucrose (W/W) in TNE. The gradient is divided into several small fractions and the virus band located by assaying aliquots of each fraction for HTLV-III-specific reverse transcriptase activity. This produces the antigen component (HTLV-III) suitable for use in ELISA or Western Blot assay procedures."

То есть Галло
1. Слил межклеточную жидкость зараженной культуры
2. Прогнал ее через ультрацентрифугирование
3. Осадок очистил от мембранных липидов и клеточного мусора посредством центрифугирования в сахарозе
4. Затем в линейном градиенте сахарозы получил мелкие фракции очищенного осадка.

Далее каждая из фракций проверялась на наличие активной обратной транскриптазы. Это Галло назвал вот так "HTLV-III-specific reverse transcriptase activity".
Если таковая обнаруживалась, то фракция шла в тесты.

Следует признать, что фраза "HTLV-III-specific reverse transcriptase activity" является ложной.
Потому что активность обратной транскриптазы в полученных фракциях может быть вовсе не HTLV-III-specific.

1. Как мы уже знаем из работы "Нестабильность генома и СПИД" при клеточном стрессе вместе с активацией генов БТШ происходит активация ретротранспозонов.

2. Вот что пишет по этому поводу известный вирусолог К.Мёллинг:
"Предполагается, что активация ретроэлементов происходит на фоне клеточного стресса. Такой стресс может быть индуцирован УФ-излучением, действием химических веществ, ядов или агентов, повреждающих ДНК. Существуют веские основания для активации ТЭ. Если клетка находится в состоянии стресса, возможно изменение ее свойств, способных помочь ей справиться со стрессом, а ретротранспозоны могут обусловить быстрое появление новых качеств и повышение выживаемости." (по книге "Вирусы: скорее друзья, чем враги", 2018).

3. Или вот работа "УФО-индуцированная экспрессия эндогенного ретровируса человека HERV-E λ 4-1 в мононуклеарных клетках крови. Гольдина И.А., Гайдуль К.В., Козлов В.А."
В этой работе приводится мимоходом один факт: у некоторой части обследуемых людей ретроэлемент присутствовал в крови до УФО-облучения.

4. Кроме того, есть много научных данных об активности ретротранспозонов в раковых клетках.
А клеточная линия Галло - раковая. То есть для появления собственной обратной транскриптазы в этих клетках не нужно индуцировать клеточный стресс. Он для них, так сказать, пройденный этап.

Могут ли ретроэлементы покинуть клетку и попасть в "межклеточную жидкость", которая использовалась при создании тестов? Да могут, если у них есть ген env. Но клетки также могут гибнуть, и содержимое их цитоплазмы со всеми белковыми комплексами будет при этом попадать в межклеточную жидкость.

Отсюда следует неизбежный вывод: в результате следования запатентованной Галло технологии белки ретротранспозонов и БТШ вполне могли составить фракции
антигенов. Но в целом одному богу известно, что содержится в этих фракциях. Потому что, повторюсь, активность обратной транскриптазы не является специфичным маркером экзогенного ретровируса. Мог в этих фракциях присутствовать какой-нибудь ретровирус? Вполне себе мог. У Галло изначально, до 1986 года, в этой клеточной линии культивировался и HTLV-1.
По факту получился неспецифичный и широкий набор антигенов, который состоит как из собственных белков организма, так и из белков ретровирусов.

Акцентируюсь еще раз на важном моменте: вся гипотеза Галло построена на том, что в нормальных лимфоцитах нет "своей" активной обратной транскриптазы. Как мы видим, тесты делались на основе этого же неверного предположения. Но при этом в исследованиях Галло и в запатентованных клеточных линиях используются лимфоциты либо от СПИД-пациентов (клеточный стресс), либо малигнизированные. То есть в обоих случаях присутствует лабильность генома и активация эндогенных ретроэлементов, с соответствующей активацией собственной обратной транскриптазы.

Для завершения картины хочется отметить, что используемый Галло метод выявления активной обратной транскриптазы (с помощью праймера oligo(dT)) не позволяет отличить "собственную" эндогенную обратную транскриптазу от экзогенной ретровирусной. Это показано в работе "Detection of reverse transcriptase activity in human cells. Kiessling AA, et al. Cancer Res. 1979.", в которой авторы проверяли специфичность этого праймера. Выводы у них такие: poly(A)-oligo(dT) -стимулированная активность свойственна нормальным человеческим клеткам. То есть она у них проявлялась
в контрольных клетках, не зараженных вирусом, не малигнизированных. Собственно, авторы делают вывод о неспецифичности данного метода для детектирования ретровирусной обратной транскриптазы.

Может быть Галло использовал какой-то собственный праймер, специфичный для HTLV-III? Не похоже.
Вот статья от декабря 1985 года:
"1985 Dec;147(2):326-35.
Characterization of the AIDS-associated retrovirus reverse transcriptase and optimal conditions for its detection in virions. Hoffman AD, Banapour B, Levy JA."

В ней используется все тот же "универсальный" oligo(dT), цитирую:
"The RNA-dependent DNA polymerase of the AIDS-associated retrovirus (ARV) gives highest activity with the synthetic template, poly(rA)oligo(dT) and prefers Mg2+ over Mn2+ as a divalent cation. It can use other template-primer combinations but with poly(rCm)oligo(dG), it prefers Mn2+ over Mg2+. Detection of ARV reverse transcriptase in culture fluids is substantially increased with an optimal KCl concentration and a special combination of EGTA and reducing agents. Our results indicate some distinguishing characteristics of the ARV reverse transcriptase and optimal conditions for its detection."

Или вот, сентябрь 1986.
Статья "1986 Sep; 59(3): 743–745.
Expression of reverse transcriptase activity of human T-lymphotropic virus type III (HTLV-III/LAV) in Escherichia coli."
Используется тот же праймер плюс еще некоторые "универсальные" праймеры, известные до мая 1984 года. То есть никакого специфичного для обратной транскриптазы HTLV-III праймера Галло и другие не изобретали как минимум до 1987 года.

Понятную исследователям неспецифичность тестов можно подкрепить ссылкой, например, на исследование "Screening and confirmatory tests for antibody to HTLV-III/LAV retrovirus in individuals at risk for AIDS.
De Majo E, et al. Ric Clin Lab. 1986 Jul-Sep." Обратим внимание на дату публикации - сентябрь 1986 года.

Вот цитата из него:
"Furthermore, the results of the present study suggest that, in addition to the Western blot technique, the competition ELISA assay as well as assays that control reactivity with H9 human cell line material may be of value for detecting false positive reactions due to antibody cross-reactive with human cellular components."

Здесь речь идет о кроссреактивности антител с человеческими клеточными компонентами, которые содержались в материале теста, полученном из той самой Н9/HTLV-III линии человеческих лимфоцитов. Авторы понимали "корень" неспецифичности теста.

Эпоха коммерческого массового использования ELISA Н9/HTLV-III длилась несколько лет, как минимум до 1987 года (помните, мы выше обращали внимание на дату публикации статьи). При помощи этих серологических тестов была создана база анализов, на которой затем проверялась специфичность следующих поколений тестов.

Читаем, например
"Update: Serologic Testing for HIV-1 Antibody --United States, 1988 and 1989"

В документе написано так:
"In 1985, the first enzyme immunoassay (EIA) for detection of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) antibody was licensed by the Food and Drug Administration; since then, the number of HIV-1 tests performed and the number of laboratories performing HIV-1 tests has increased steadily. Because of the need to assess the quality of existing laboratory technology and to ensure the quality of testing, the Model Performance Evaluation Program (MPEP) was implemented by CDC in 1986 to evaluate the performance of laboratories testing for HIV-1 infection (1). Approximately 1400 U.S. and international laboratories participated in the MPEP during 1988 and 1989. The total number of laboratories performing HIV-1 testing is unknown. Laboratories in the MPEP voluntarily report results from coded plasma samples for which HIV-1-antibody reactivity has been determined through composite testing at CDC and verified at candidate reference laboratories (Table 1). Participants also complete survey forms describing laboratory characteristics and testing practices. This report summarizes data for the 752 U.S. MPEP laboratories that returned complete results in both May 1988 and August 1989*. Performance is described in terms of analytic sensitivity, analytic specificity, and overall analytic performance.** Performance was calculated based on a laboratory's test results for samples that were typical of most samples routinely tested for HIV-1 antibody. Enzyme Immunoassays The analytic sensitivity of EIAs for HIV-1 antibody performed for MPEP in 1988 was 99.7% (6545 reactive test results out of 6566 positive samples) (Table 2); analytic specificity was 98.5% (3004 nonreactive test results out of 3051 negative samples). The overall analytic performance of EIAs was 99.3% (9549 correct results out of 9617 tests)." 

Выделил жирным ключевую фразу:
"аналитическая специфичность составила 98,5% (3004 нереактивных результатов теста из 3051 отрицательных образцов)". 

То есть специфичность иммуноферментных тестов следующих поколений проверялась на старых образцах сыворотки, отобранных так же методом иммуноферментных тестов предыдущего поколения. При таком подходе должна быть какая-то начальная группа образцов сыворотки. А ей неоткуда взяться кроме как из образцов, наработанных до 1987 года с помощью тестов ELISA Н9/HTLV-III, про "специфичность" которых я писал выше. Короче, тесты нового поколения подгонялись под старые неспецифичные образцы сыворотки.

Надо некоторое резюме сделать. Существуют демагоги, которые утверждают примерно следующее: да, работы Галло были слабоваты, но они были первыми, потом они подтвердились клонированием; да первые тесты были так себе, но новые поколения высоко специфичны.
Это чушь. Нельзя на гнилом фундаменте построить нормальную теорию. Нельзя на базе неспецифичных образцов получить специфичные тесты. Новые исследователи вынуждены поддерживать "обратную совместимость". Нельзя так просто сказать: ребята, новые поколения тестов показали "-", вы оказывается здоровы. И никакого заговора тут нет, а есть скорее опасение крупных судебных исков. Поэтому обратная совместимость так и будет поддерживаться на административном уровне.
Subscribe

Recent Posts from This Journal

  • Post a new comment

    Error

    Anonymous comments are disabled in this journal

    default userpic
  • 0 comments