cryptopolicy (cryptopolicy) wrote,
cryptopolicy
cryptopolicy

Categories:

Нюансы в клонировании ВИЧ

При клонировании ВИЧ Р. Галло делал следующее:


(1) свежую культуру H9 (HUT-78) заражал супернатантом из культуры, в которой сокультивировались активированные лимфоциты 10 пациентов с признаками СПИДа с клетками H9 (Т-клетками пациента с лимфомой);


(2) проводил центрифугирование супернатанта зараженной культуры H9;


(3) проводил обратную транскрипцию всех poly(A)-РНК из частиц, сконцентрировавшихся в градиенте плотности 1, 16, сформировав таким образом библиотеку кДНК;


(4) экстрагировал из клеток low-weight ДНК, гибридизировал их с кДНК для проверки на наличие генома ВИЧ; 


(5)  загонял давшие сигнал low-weight ДНК в фаговый вектор;


(6) высевал клетки E.cori на питательной среде;


(7) заражал их сильно разведенным раствором с фагами, получившимися на шаге (5);


(8) после образования негативных фаговых колоний (фаговых бляшек) проводил их скрининг посредством гибридизации с кДНК;  


(9) отбирал давший сигнал клон (полноразмерный клон был назван BH-10). 




Однако, имеются данные, что:


(10) при ВИЧ-инфекции из плазмы можно получить вирионы HERV-K, которые концентрируются центрифугированием в градиенте 1, 16;


(11) стимулированные Т-лимфоциты в культуре экспрессируют вирионы HERV-K;


(12) экспрессированные частицы HERV-K переносят свою геномную НК и могут проникать в другие клетки;


(13) полный геном HERV-K примерно равен по размеру полному геному ВИЧ, поэтому их невозможно разделить по длине в геле.


Таким образом, на основе (10, 11, 12, 13) можно предположить, что в супернатанте (2) были вирионы HERV-K, которые попали в градиент плотности 1,16, и обратные транскрипты с генома которых попали в библиотеку кДНК (3), а неинтегрированные геномы (low-weight ДНК, 4) в фаговые векторы (5). 




Могли ли шаги (6 — 9) разделить ДНК ВИЧ и ДНК HERV-K, и не могла ли ДНК HERV-K попасть в фаги, образовавшие бляшку, из которой произошел клон BH-10?


Скрининг посредством кДНК (8) дал бы сигнал на бляшке, которая содержит только ДНК ВИЧ или только ДНК HERV-K или ДНК ВИЧ и ДНК HERV-K вместе. Поэтому скрининг не поможет выделить бляшку, которая содержит только ДНК ВИЧ.


Считается, что все фаги, образующие одну бляшку, имеют одинаковую вставку ДНК, то есть являются потомством одного фага.


Так ли это на самом деле? Подобным вопросом задается один исследователь здесь https://www.researchgate.net/post/How_to_determine_the_diversity_of_phage_display:


«I don't understand this part. I mean how do you know that in a single colony that you won't have different sequences. Why can't a single colony have more than one diversity (more than one sequence)?»


На это он получает такие ответы.


Ответ первый:


«... It is based on two main assumptions. None of them is 100% true


1. There is no more tan one inserted gene in each E.coli colony. Depending on the ratio between electrocompetent cells and plasmid DNA during transformation in library construction, and on the ratio between E.coli cells and phages during infection after selection rounds, this can be approximately true or not. when using large amounts of DNA/phages and not so many cells this assumption may be completely false.


2. Every colony contains a different DNA. In normal situations, its true that most colonies contain different DNAs, at least in the original library and probably after the first round of selection. Anyway, some colonies can be replicates of the same clone. After selection, diversity diverges from the number of colonies because enrichment means that the same clone is repeated multiple times.»


 И далее:


«Yes. Actually each colony is a pure strain because all the cells come from a single one. But this single cell can contain more than one phagemid (if an excess of DNA was used for electroporation, for instance) so cells in the progeny (same colony) can keep one of them, or even the whole mixture. It introduces some heterogeneity in the theoretically pure strain.»


Итого, в случае наличия HERV-K в градиенте (3) нет гарантий, что клон BH-10 состоит только из генома ВИЧ.  


Гетерогенность «теоретически чистого» клона способна привести к неточному секвенированию. Неточное секвенирование приводит к появлению неспецифических праймеров для ПЦР.  

Subscribe

Recent Posts from This Journal

  • Post a new comment

    Error

    Anonymous comments are disabled in this journal

    default userpic
  • 2 comments