cryptopolicy (cryptopolicy) wrote,
cryptopolicy
cryptopolicy

Category:

Клонирование ВИЧ . Часть 1.

Тема большая. Будем ее разбирать по частям.

Что такое клонирование? Из википедии:

1) Клони́рование (в биологии) — появление естественным путём или получение нескольких генетически идентичных организмов путём бесполого (в том числе вегетативного) размножения.

2) Термин «клонирование» в том же смысле нередко применяют и по отношению к клеткам многоклеточных организмов.

3) Клонированием называют также получение нескольких идентичных копий наследственных молекул (молекулярное клонирование).

4) Наконец, клонированием также часто называют биотехнологические методы, используемые для искусственного получения клонов организмов, клеток или молекул.
_______________

Логично ожидать, что ВИЧ был клонирован по следующей схеме. Из клеточной культуры СПИД-пациента выделен очищенный вирион ВИЧ, из него выделена молекула наследственности ВИЧ (РНК), эта молекула каким-либо способом встроена в ДНК лимфоцитов в неинфицированной культуре, после этого в культуре появились вирусные частицы, эти частицы выделены и очищены, показано, что их РНК идентична РНК ВИЧ.

Каким способом наследственная информация (молекула ДНК/РНК) может быть встроена в геном клетки?

Существует два способа: вирусный и невирусный.

В первом случае вирусная частица некоторым способом (например, "приклеившись" к клеточному рецептору) проникает внутрь клетки, открывает свою оболочку, и хранящаяся внутри молекула наследственности специальными вирусными ферментами встраивается в ДНК самой клетки. Вирусный способ передачи информации специфичен для клеток определенного фенотипа, например, как считается в случае ВИЧ, несущих рецептор CD4. Встроенный фрагмент ДНК называется провирусом. Далее этот фрагмент ДНК активируется клеточными ферментами и клетка начинает производить вирусные частицы (вирионы). Производство вирионов - это отдельный сложный процесс, который сейчас рассматривать смысла не имеет.
К вирусным способам встраивания наследственной информации относятся собственно вирусная инфекция, в биотехнологии используют специальные вирусные векторы.

Невирусные способы встраивания наследственной информации в клетку основаны на прямом проникновении молекул ДНК/РНК через клеточную мембрану. В биотехнологии это называется трансфекцией. Например, в клеточную культуру добавляются молекулы ДНК, затем физическими или химическими методами создаются условия, при которых повышается проницаемость клеточных мембран. Молекула ДНК проникает через клеточную мембрану в клетку, затем "подхватывается" клеточными ферментами и встраивается в ДНК клетки. Следует отметить, что методом трансфекции в геном клетки может быть встроена наследственная информация как в виде молекулы ДНК, так и РНК.

Имеются данные, что у раковых клеток аномальная проницаемость клеточной мембраны, поэтому трансфекция в раковых клеточных культурах производится легко, эти клетки жадно "втягивают" в себя окружающие молекулы.

У нормальных клеток мембрана надежно защищает от проникновения внутрь внешней молекулы РНК/ДНК, поэтому для успешной трансфекции в них требуется искусственное повышение проницаемости мембраны.

Во всех экспериментах Галло и в работах последующих исследователей использовалась клеточная линия малигнизированных (раковых) лимфоцитов под названием H9.

Рассмотрим работы, в рамках которых производилось клонирование ВИЧ и постараемся понять, что же было доказано в этих работах.

Началось все с выявления вирусной РНК.
Arya SK, Gallo RC, Hahn BH, Shaw GM, Popovic M, Salahuddin S, Wong-Staal F. Homology of genome of AIDS-associated virus with genomes of human T-cell leukemia viruses. Science 1984. 225:927-930.

1. Лимфоциты из СПИД-пациента культивировались совместно с раковыми клетками в линии H9. Супернатант (осадок межклеточной жидкости) данной линии добавлялся в незараженную линию H9. Супернатант этой второй линии H9 прогонялся через центрифугу. По другим данным в центрифугу шел супернатант непосредственно из первой линии.

В градиенте плотности, свойственном ретровирусным частицам (полным вирионам, "шарикам из белков внутри которых РНК"), оказывались какие-то молекулы.
Следует отметить, что никаких полных вирионов в градиенте не было, был просто молекулярный хаос.

2. Специальными методами из этих молекул выделялись молекулы РНК.
Точнее poly(A)РНК. Это разновидность матричной РНК.
Некоторые из данных молекул были объявлены геномом ВИЧ.

Следует понимать, что poly(A)РНК не является специфичной для ретровирусов.

3. Исследователями была проведена обратная транскрипция данных poly(A)РНК. В результате были синтезированы молекулы ДНК (комплементарные ДНК - кДНК).
Эти кДНК оказались разной длины - от 0,1 до 10 КБ. Официальная длина генома ВИЧ порядка 10 КБ.

То есть даже в официальном эксперименте из градиента были получены совершенно разные РНК. Некоторые из них были трактованы как геном экзогенного ретровируса. Что же тогда представляли собой другие РНК? Ответа на этот вопрос исследователи не дали.

Хочу еще раз подчеркнуть, вирусная РНК была получена не из очищенного вириона, а из молекулярной каши, образовавшейся в центрифуге в градиенте плотности, в котором должны были находиться ретровирусные частицы. Исследователи в работе не предоставили фото этого градиента, фото последующих экспериментов свидетельствуют, что получается именно молекулярная каша без характерных вирионов с торчащими из них gp120.

Таким образом, уже в этом эксперименте нарушены два условия корректного клонирования:

1. Супернатант, из которого выделялась РНК, получен не из культуры СПИД-пациента, а из раковой линии, в которой сокультивировались лимфоциты СПИД-пациентов.

Как выяснилось позднее, в раковой линии велось сокультивирование лимфоцитов от порядка 10 пациентов.
За это Галло был "судим" своими коллегами в начале 90-х и, судя по всему, из-за этого пролетел с нобелевской премией.
Дело в том, что еще до работ Галло было показано, что сокультивирование клеток от разных людей ведет к появлению ретровирусных частиц в культуре. Нобелевский комитет имел все основания сомневаться, что Галло в своих работах выделил ВИЧ.

2. "Вирусные" РНК получены не из очищенного вириона, а из молекулярной каши, которая присутствовала в градиенте плотности. Какая-либо связь этих РНК с вирусом не доказана в данном эксперименте.
Subscribe

Recent Posts from This Journal

  • Post a new comment

    Error

    Anonymous comments are disabled in this journal

    default userpic
  • 0 comments