cryptopolicy (cryptopolicy) wrote,
cryptopolicy
cryptopolicy

Categories:

Клонирование вирусов - почему одна вставка?

В предыдущем посте по клонированию я не смог внятно описать проблему, которая, как мне представляется, имеется.

Давайте рассмотрим на примере.

Это описание клонирования ВИЧ - никаких отклонений от стандартных методов клонирования для других вирусов нет
:

1. Берутся все ДНК малой массы из культуры (среди которых как бы есть неинтегрированный провирус)
2. Режутся специальным типом рестриктаз
3. "Обрезки" загоняются в плазмиду
4. Раствор с плазмидами наносится на культуру e. coli, плазмиды заражают клетки
5. ДНК из образовавшихся бляшек проверяется на наличие генома ВИЧ посредством гибридизацим с ВИЧ-зондами (получены посредством обратной транскрипции всех poly(a)-РНК из градиента).
6. Фаги из бляшек, давших сигнал на скрининге, объявляются клоном.

Проблема, однако, в том, что на этапе 3 в плазмиды может быть загнан не только неинтегрированный провирус, но и иные короткие ДНК, порезанные конкретным видом рестриктаз. То есть плазмиды могут нести разные вставки. Затем на этапе заражения e.coli плазмиды с разными вставками могут заразить одну клетку. Таким образом, в бляшке могут быть фаги как с вирусными, так и с не-вирусными вставками. И такая бляшка пройдет отбор: скрининг посредством гибридизации на вирусных зондах.
Соответственно, ДНК из нее будут считаться однородными, по факту такими не являясь. Это не клон, короче.

Поэтому у вирусологов априори считается, что одна бляшка произошла из клетки, которая была заражена только одной плазмидой. Если данную "аксиому" выбить из фундамента вирусологии, то появляется масса вопросов, самый важный из которых - что за секвенс получается в результате секвенирования подобного "гетерогенного клона"?

Но вот эту априорность вирусологи обосновывают слабо, якобы разведением раствора с плазмидами и ловкостью в обращении с пипеткой можно ее добиться.
Subscribe

Recent Posts from This Journal

  • Post a new comment

    Error

    Anonymous comments are disabled in this journal

    default userpic
  • 5 comments