cryptopolicy

Откуда взялась РНК якобы коронавируса (1)

Будем по частям разбираться и в обратной временной последовательности. Так сказать сериальчик. Потом из этого винегрета попробуем слепить обзор.

1. Статья о секвенировании SARS от 2003 года сообщает нам, что на тот момент было секвенировано 6 геномов коронавирусов.

Six species of CoV genomes have been completely sequenced, namely murine hepatitis virus (MHV) (4); avian infectious bronchitis virus (IBV) (5); human CoV 229E (HCV 229E) (6); bovine CoV (BCV) (7); transmissible gastroenteritis virus (TGEV) (8); and porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) (9). 

Для секвенирования штамма HKU-39849 они использовали ОТ-ПЦР .

Праймеры для «выделения» фрагментов, из которых они слепили итоговую секвенс РНК, дизайнили на основе предыдущих версий коронавирусов и штамма Tor2 SARS, который вроде как первый секвенированный штамм SARS-ассоциированного вируса:

Degenerated primers covering the whole genome of the CoV were designed based on the genomic sequences of other CoVs. With assistance from the results obtained from library screening, degenerated primers amplification, primer walking, and other public sources (e.g., SARS CoV strain Tor2, GenBank accession number NC_004718), the gaps in the genome were finally closed by specific primer PCR and sequencing.

Поиски того, как была получена секвенс штамма Tor2 приводят нас на эту статью

Purification of viral particles and RNA, and DNA sequencing. Virus isolation was performed on a bronchoalveolar lavage specimen of a fatal SARS case belonging to the original case cluster from Toronto, Canada. Viral particles from this Tor2 isolate were purified, and the genetic material (RNA) was extracted (14) from the Tor2 isolate (15). The RNA was converted to cDNA by means of a combined random-priming and oligo(dT) priming strategy (14). Size-selected cDNA products were cloned, and single sequence reads were generated from each end of the insert from randomly chosen clones. Sequences were assembled and the assembly was edited to produce a draft sequence of the viral genome on 12 April 2003 (14).

Пишут о некой очистке вирусных частиц. Лезем в (14) — это они методы вынесли в отдельный материал — там:

When infected cells showed a cytopathognic effect of ‘4+’ (48 hours post infection), the cultures were then frozen and thawed to lyse the cells, and the supernatants were clarified from cell debris by centrifugation at 10,000 rpm in a Beckman high-speed centrifuge. The supernatants were treated with DNAse and RNAse for 3 hours at 37°C to remove any cellular genomic nucleic acids and subsequently extracted with an equal volume of 1,1,2-trichloro-trifluoroethane. The top fraction was ultra-centrifuged through a 5% / 40% glycerol step gradient at 151,000 × g for 1 hour at 4°C. The virus pellet was resuspended in PBS. RNA was isolated using a commercial kit from QIAGEN and stored at –80°C for further use.

То есть они налили лаваж в клетки Vero E6, подождали, разломали оболочки клеток, очистили от крупных обломков, обработали  ДНКазой/РНКазой, потом получили из оставшегося взвесь липидосодержащих частиц (extracted with an equal volume of 1,1,2-trichloro-trifluoroethane), верхние фракции которой были центрифугированы в градиенте плотности глицерина. Фракции из полос 5-40% объявлены очищенным вирусом.

На самом деле в этих фракциях полно клеточных органелл, которые содержат нуклеиновые кислоты.  

Если есть у кого желание можно найти примеры очистки этих органелл в градиенте глицерина, я их добавлю в статью. 

Далее обсудим как же была получена секвенс этого первого SARS. 


Error

Anonymous comments are disabled in this journal

default userpic