cryptopolicy

Category:

Что не так с гелем Сенгера

В продолжение темы невозможности гелей Сенгера.

Основополагающая работа Сенгера по секвенированию методом обрыва цепи начинается с представленного ниже геля. Интерпретация данного геля, как набора «обрезанных» фрагментов, по которым якобы можно определить последовательность цепи, которая была шаблоном для их синтеза — смахивает на ошибку. Ниже будут представлены доказательства.   

Fig. 1 из https://sci-hub.do/10.1073/pnas.74.12.5463
Fig. 1 из https://sci-hub.do/10.1073/pnas.74.12.5463

Сенгер использовал 12% акриламидный гель в котором разделял денатурированные ДНК.

Разрешающую способность акриламидных денатурированных гелей можно посмотреть тут:

Для 12% геля не сильно ошибемся, если предположим, что эффективное разделение будет для цепей ДНК в 15-85 нуклеотидов.

Задублируем эту информацию данными отсюда:

Здесь тоже видно, что 12% гель не способен эффективно разделять фрагменты больше 80 нуклеотидов. 

Посмотрим, что за фрагменты ДНК на представленном выше геле из работы Сенгера. 

In the experiment shown in Fig. 1 two small restriction enzyme fragments (A12d and A14, ref. 2) were used as primers on the complementary strand and there was no final digestion step to cut between the primer and the newly synthesized DNA.  

То есть Сенгер в качестве праймера использовал рестрикционный фрагмент A12D и затем не отрезал его у синтезированных «оборванных цепей» перед разделением их на геле.

Какова длина праймера Ad12? Найти ее можно здесь и длина в районе 80 нуклеотидов.

Это сочетается с фразой из статьи:

The sequences can be read with reasonable accuracy starting at 88 nucleotides from the 5' end of the primer for about 80 nucleotides (apart from some difficulty at position 3459 with A12d). For the next 50 nucleotides there is some uncertainty in the number of nucleotides in "runs" because bands are not actually resolved.

Таким образом, все фрагменты ДНК на фиг. 1 (верхняя картинка в посте) состоят из 80 нуклеотидного праймера + синтезированного фрагмента длиной до 130 нуклеотидов.  Таким образом, фрагменты выше красной линии имеют диапазон 88 — 213 нуклеотидов.

А теперь еще раз смотрим в таблицу с сайта Термофишера и видим, что на 12% геле фрагменты ДНК из этого диапазона разделить просто невозможно. 

Другой нюанс состоит в том, что на фиг. 2 из Сенгера представлено разделение фрагментов ДНК в том же 12% геле, но уже с отрезанными праймерами:

With longer restriction enzyme fragments as primers it is necessary to split them off from the newly synthesized DNA chains before the electrophoresis. This is normally done by digestion with a restriction enzyme. Fig. 2 shows such an experiment in which fragment R4 was used as primer on the complementary strand of OX174 DNA.   

То есть здесь уже на том же самом 12% геле разделяются фрагменты длиной 10 — 160 нуклеотидов и по ним делается вывод о якобы секвенсе матрицы.   

В общем, у Сенгера 12% гель эффективно разделяет фрагменты на всем диапазоне 10-213 нуклеотидов, чего быть не может — это просто противоречит  данным, полученным при калибровке гелей посредством синтетических ДНК-маркеров.

Error

Anonymous comments are disabled in this journal

default userpic