cryptopolicy (cryptopolicy) wrote,
cryptopolicy
cryptopolicy

Categories:

К вопросу о специфичности ПЦР для ВИЧ

Всем известно, что ПЦР является 100% специфичным анализом. Если ПЦР подтвердил ВИЧ+, ошибки быть не может. Но есть один человек, который не считает анализ ПЦР специфичным для ВИЧ и это изобретатель метода - К.Муллис. К.Муллис обладает некоторыми странностями, но истории про инопланетян не мешают оставаться г-ну Муллису крупнейшим экспертом в области ПЦР. Так в чем может быть проблема с ПЦР?



Специфичность ПЦР во многом определяется специфичностью праймера. Вернее, специфичность ПЦР-диагностики основана на специфичности праймера.
Если праймер смог распознать сайт-мишень на матрице ДНК, то он к нему присоединится по принципу комплементарности, и запустится амплификация.

В чем принципиальная особенность ВИЧ? Нестабильность генома. То есть большая часть вируса подвержена мутациям, но есть короткие консервативные сайты, мутации в которых приводят к отсутствию репликационного потенциала у вириона. Поэтому в качестве провируса в ДНК человека ищутся именно консервативные последовательности.

Праймеры для поиска консервативных последовательностей гена gag разных штаммов ВИЧ:

инициирующие синтез против хода транскрипции:
SK145 (SEQ ID NO: 1)
5'-AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT-3' 

SK145M2 (SEQ ID NO: 2)
5'-AGTGGGGGGACACCAGGCAGCAATGCAAAT-3' 

инициирующие синтез по ходу транскрипции:
SKCC1 (SEQ ID NO: 3)
5'-TACTAGTAGTTCCTGCTATGTCACTTCC-3'

SKCC3 
(SEQ ID NO: 4)
5'-TGAAGGGTACTAGTAGTTCCTGCTAT-3'

Рассмотрим подробнее праймер SK145.
Какую последовательность ВИЧ он амплифицирует?
Строим для него комплементарную последовательность TCACCCCCCTGTAGTTCGTCGGTACGTTTA, разворачиваем ATTTGCATGGCTGCTTCATGTCCCCCCACT.

Ищем в blast. Выдает геномы hiv1. Все корректно.

Включаем поиск только в человеческом геноме. 
Находим разные неполные совпадения, вот интересное:

Homo sapiens chromosome 3, GRCh38.p12 Primary Assembly

Query 1 ATTTGCATGGCTGCTTCATG 20
|||| |||||||||||||||
Sbjct 27793412 ATTTTCATGGCTGCTTCATG 27793431

Мы видим практически 100%-ое совпадение в геноме человека с первыми 20-ю основаниями амплифицируемой последовательности ВИЧ. При этом данное совпадение комплементарно 3'-концу праймера. 
Запомним это.

Теперь немного о проектировании праймеров.

Из статьи "ОСНОВНЫЕ АСПЕКТЫ КОНСТРУИРОВАНИЯ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ДНК КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ":
"Специфичность. В идеале праймер должен обладать 100 %-ной комплементарностью по отношению к сайту-мишени и не распознавать другие, даже очень близкие по нуклеотидному составу, последовательности. Однако практика показывает, что эффективными могут быть и праймеры, не обладающие 100 %-ной комплементарностью и имеющие достаточно высокую степень гомологии (но не более 70 %) по отношению к другим нуклеотидным последовательностям."

Из книги "Современные проблемы биохимии. Методы исследований":
"по мере необходимости допускается присоединение к 5'-концам праймеров некомплементарных матрице последовательностей, которые могу заключать в себе требуемые сайты рестрикции, промоторные участки ..."

Или вот из статьи:
"Интереснейший взгляд на конструирование прймеров выражают CODEHOP-праймеры. Они показали высокую эффективность при клонировании представителей мультигенных семейств [Rose et al., 2003]. Мэйнстримом при создании праймеров становится представление о том, что их 3'-конец отвечает за чувствительность (то есть, способность разделять комплементарные и некомплементарные участки матрицы), а 5'-конец придает способность прочно связываться с матрицей [Sommer & Tautz, 1989]. Поэтому CODEHOP-праймеры состоят из участков, разнящихся по степени соответствия матрице и принципу их выведения. Более короткий 3'-участок (11-12 осн.) является полностью вырожденным и представляет все возможные пути кодирования данной аминокислотной последовательности. Более длинный 5'-участок (20-30 осн.) лишь приблизительно представляет кодирующую последовательность, но оказывается достаточным для надежного удержания праймера на матрице."

Или вот специализированный форум
http://molbiol.ru/forums/lofiversion/index.php/t436816.html
Тема:
"Насколько безболезненно вешать некомплементарные нуклеотиды на 5'-конец праймера. Есть ли какие нибудь предпочтения, если просто хочется удлинить ПЦР продукт нуклеотидов на 10-20?"

Специалисты отвечают, что навешивали на 5'-конец праймера некомплементарные цепочки без потери эффективности ПЦР.

Или вот с этого же форума:
"molbiol.ru/forums/lofiversion/index.php/t46052.html":
"...На 5' конец можете нацепить хвост какой угодно хоть 20 нуклеотидов (лично делала). На 3' конце последний нуклеотид должен быть комплементарен, перед ним можно ставить 1-2 некомплементарных мой личный рекорд три некомплементарных основания, но эффективность амплификации была не очень. Ну а в середине (например для мутагенеза) можно и шпильку вставить 5-6 букв."

К чему я веду? Для успешного ПЦР полная комплементарность праймера к матрице не нужна. Комплементарность важна для 3'-конца праймера, требуемый размер комплементарной последовательности 11-12 оснований. Основания с 5'-конца праймера не обязаны быть полностью комплементарны матрице, но их последовательность должна хоть как-то держаться на матрице.

А blast, как было показано выше, нашел в геноме человека последовательность, которая комплементарна 3'-концу праймера SK145, размер ее составляет 20 оснований.
Для наглядности:
5'-AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT-3'
в праймере жирным выделена последовательность, комплементарная к человеческому геному. А 5'-AGTGGGGGGA для амплификации, как было показано выше в цитатах, должна хоть как-то удержаться на матрице.

Праймер вполне может гибридизироваться с последовательностью из
Homo sapiens chromosome 3, GRCh38.p12 Primary Assembly, и начнется амплификация. С последующим прохождением сигнала и ложноположительным ПЦР. Без всякого ВИЧ.

Если с помощью blast поискать в геноме человека первые 12 оснований ATTTGCATGGCT, комплементарные 3'-концу праймера SK145, то мы найдем 148 последовательностей. Число 12 взято на основании процитированной выше статьи о стратегии разработки праймеров.

Итак, существуют 148 последовательностей в геноме человека, на которых потенциально возможна неспецифическая амплификация с помощью праймера SK145.

При этом для последовательности из Homo sapiens chromosome 3, GRCh38.p12 Primary Assembly, этот сценарий, на мой взгляд, очень вероятен, так как ее первые 20 оснований комплементарны первым 20 основаниям 3'-конца праймера, при общей длине праймера в 30 оснований.

Остальные 147 последовательностей нуждаются в дополнительном рассмотрении. То есть надо смотреть последовательности, которые идут за ними в геноме человека, и прикидывать, сможет ли цепочка из 18 оснований праймера (5'-AGTGGGGGGACATCAAGCA), не будучи полностью комплементарной, удержаться на них.

UPD: одна их них (под ней последовательность из gag ВИЧ)
ATTTGCATGGCTG GC T TC TG CT C TG CC TTC
ATTTGCATGGCTG CT T CA TG TC C CC CC ACT
Это будет амплифицировано с высокой степенью вероятности.

Если есть какие-либо исследования, в которых показано, что праймер SK145 не гибридизируется ни с одной из этих 148 последовательностей, то было бы интересно на них взглянуть.

В патентах на праймеры для ВИЧ результаты тестов на специфичность обнаружить не удалось, только на чувствительность.
Tags: ВИЧ, ПЦР
Subscribe
  • Post a new comment

    Error

    Anonymous comments are disabled in this journal

    default userpic
  • 8 comments